再生水灌溉对地下水质量的影响主要来自盐分、硝态氮、新型污染物和病原菌等几个方面。
1、盐分
长期再生水灌溉下，盐分及盐分离子的地下水迁移广受关注。研究表明北京西南郊浅层地下水受长期再生水(早期为污水)灌溉影响，其氯化物、硫化物、钠盐以及总硬度明显增加，硝酸盐氮污染严重，亚硝酸盐氮和氨氮含量逐年上升。
再生水灌溉对地下水的影响与灌溉水质、土壤质地及地下水位等密切相关，总的来说，国内再生水灌溉造成地下水盐分及相关离子污染的案例并不多见(除污灌外)。在长期再生水灌溉时，有必要运用DRASTIC等经验模型或HYDRUS、ENVIRO-GRO等动态模型对地下水污染脆弱性评估，确保地下水安全。
2、硝态氮
土壤-植物体系中水、盐、氮素之间存在高度的反馈机制，长期再生水灌溉可影响土壤氮素利用与迁移。一方面，再生水灌溉下，随着土壤硝态氮浓度的增加以及溶解氧的下降，其反硝化作用增强，可以减少氮素渗漏对地下水的威胁；另一方面，土壤盐分的累积可降低作物吸水和氮素吸收，进而增加土壤氮素的淋溶。吴文勇等对北京市再生水灌区调蓄工程对地下水盐分的影响的研究结果显示，未发现再生水调蓄工程蓄水导致地下水水质发生明显变化。但在一些特殊情况下，氮的去除率较低，可导致地下水硝态氮含量的增加。国外的一些研究也表明，再生水灌溉可导致地下水硝酸盐含量有所增加。
总体上，再生水中氮含量较高，进入土壤后，氮素在各种驱动力作用下不断转化，虽然现有的研究显示因再生水灌溉导致地下水氮污染的可能性较低，但长期再生水灌溉下，依然存在硝态氮污染地下水的风险。
3、新型污染物
随着监测技术的提高，再生水灌溉下污染物的地下水污染风险开始受到关注。通过长期对再生水利用样地设置地下水监测井，进行长期定位监测。新型污染物种类繁多，有些污染物去除速率较慢，可以在土壤中长期残留，对地下水体存在潜在威胁。
4、病原菌
再生水中含有多种病原微生物，除在空气中传播造成直接的健康风险外，再生水中的这些病原菌也可能到达地下水，威胁饮水安全。在使用再生水灌溉绿地时发现，在两次灌溉之间土壤表面变干时。大肠杆菌会很快死亡，超过90%的大肠杆菌会保留在土壤表层的2.5cm之内，决不会渗透到30cm以下深度。因此，再生水中的大肠杆菌不会对地下水造成污染。