核酸探针法检测对虾疫病

2023-04-30 16:00

1.采样器具

眼科剪刀、眼科镊、牙刷、样品容器(1.5毫升塑料离心管、5―10毫升青霉素小瓶等小型具塞容器)、标签纸、铅笔、样品记录、烧杯或水杯、滴管、SEMP采样液、1摩尔/升HCl、1%一5%新配制的高锰酸钾或漂白粉。

2.采样部位

亲虾:濒临死亡的亲虾或已冰冻的亲虾,采取少量虾胃,每样品重0.1―2克。

各生长期对虾:采集虾胃,3厘米以下样品可取虾头。每样品重0.1―2克。

3.操作步骤

3.1 清洗采样容器及器具(用过的容器需用1摩尔/升HCl浸泡2小时),每个采样容器加入0.5毫升SEMP采样液。

3.2 金属器具每次使用后需在5%新配制的高锰酸钾或漂白粉溶液中浸泡5分钟,清水洗净。

3.3 采集样品放入容器中与采样液混匀,一份样品一个容器。

3.4 用铅笔在标签上编号并记录样品编号、种类名称、采集地点、时间、保存方法等信息。

4.检测操作

4.1 泡膜、点样和交联

杂交膜用蒸馏水和泡膜液分别浸泡5和10分钟,晾干。

研磨样品离心后取上清,于100℃煮沸10分钟,迅速冰浴2分钟以上。

点样于测试膜和参照膜对应方格,晾干后在80℃恒温箱烘烤2小时。

4.2 预杂交和杂交

配制预杂交液,将膜置于杂交袋中,70℃孵育0.5―2小时。

探针煮沸10分钟后冰浴,加入测试膜杂交袋中,70℃孵育过夜。

4.3 加入抗体

用清洗液I、II洗涤膜,缓冲液A洗涤后封闭30分钟,加入抗体室温振荡30分钟。

4.4 显色、观察和记录

用缓冲液A、B洗涤膜,配制显色液显色30分钟至2小时。显色后立即水洗终止,晾干观察记录结果。

5.结果判断

以阳性对照颜色为标准:

样品颜色相近或相同为病毒携带者;

颜色更深为已发病或临死状态;

不显色为不带病毒。阴性对照显色需重做。

(注:自备器材包括镊子、剪刀、离心机、恒温箱等,未重复列出。)

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