牛肠杆菌科细菌鉴定的一个重要依据是形态学特征。这些细菌为革兰氏阴性菌，菌体呈杆状，通常是直杆状或稍呈弧形。在显微镜下观察时，可见其形态特征有助于初步鉴定，如菌体的形状、大小和排列方式等。
生化试验是另一个重要依据。通过对细菌进行生化反应的检测，可以确定其代谢特征和功能，如利用琼脂糖凝胶电泳检测代谢酶活性，或通过培养基检测细菌对不同底物的反应。这些结果可与已知细菌进行对比来分类。
此外，分子生物学方法已成为重要手段。通过PCR扩增特定基因片段如16S rRNA基因，再经测序和数据库比对，可准确确定菌株的亲缘关系和分类信息。